【摘要】　目的　探究龈沟液中是否存在白细胞介素8（interleukin-8, IL-8）的抑制因子。方法　(1)将13例成人牙周炎的14份及8例牙周健康者的9份龈沟液样本各自一分为二，1/2加入丝氨酸蛋白酶抑制剂──苯甲基磺酰氟，另1/2加入等量的磷酸盐缓冲液作为对照。ELISA法检测各样本中的IL-8含量。(2)对15例成人牙周炎的41份龈沟液样本，用间接ELISA法测定龈沟液中的IL-8自身抗体（IgG）。 结果　(1)加入酶抑制剂的龈沟液中IL-8的检出量（3.01mg/L±5.79 mg/L）显著高于对照组（0.05mg/L±0.15 mg/L），P<0.001。(2)龈沟液中IL-8自身抗体水平高于阴性对照标准差3倍。龈沟液中加入大肠杆菌超声粉碎液对此检测结果无明显影响。结论 　 龈沟液中存在能降解IL-8的丝氨酸蛋白酶；成人牙周炎的龈沟液中存在IL-8自身抗体。
　　【关键词】　 白细胞介素8 　　 抑制因子 　　丝氨酸蛋白酶 　　自身抗体 　　 龈沟液

　　白细胞介素8(interleukin-8, IL-8)是一种主要由单核细胞分泌、具有多种生物学功能的细胞因子，其主要作用是趋化和激活多形核白细胞。 曾有报道，47.7%和31%的牙周炎患者龈沟液中未能检出IL-8［1, 2］。我们在一部分牙周炎患者龈组织匀浆中也未能检出IL-8，并发现牙周炎龈沟液中存在IL-8的抑制因子［3］。为探明IL-8抑制因子的性质，我们做了如下研究。

材料和方法

　　 1.病例选择及龈沟液取样：从北京医科大学口腔医学院牙周科选择全身健康、3个月内无抗生素应用史及牙周治疗史的成人牙周炎患者13例（AP组），其中男性9例，女性4例。共选择牙周袋深度4～6mm、探诊出血指数2～4的患牙14颗。另选牙周健康者8例，其中男性5例，女性3例，共9颗牙。用经0.1%牛血清白蛋白（BSA）预处理过的3个Whatman 3# 滤纸条，分别放入所选牙的近中、远中和中央牙周袋(沟)内，30秒时取出［4］。将每颗牙的3个滤纸条放入同一Eppendorf管，作为1个样本，-20℃保存备用。
　　2.龈沟液混合样本的制备：41份龈沟液样本分别取自15例成人牙周炎患者,牙周袋深4～10mm，出血指数≥2。离心洗提后，将所有洗提液混合在一起待检。
　　3.大肠杆菌超声粉碎液的制备：将5×1011细胞／升的大肠杆菌悬液于60℃，30min热致死后，超声粉碎5min，使95%以上的细胞裂解。用0.1%BSA-PBS将其倍比稀释成9个浓度梯度备用。
　　4.酶抑制实验：将没有混合的每份龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF) 样本加0.1%BSA-PBS-T液（含0.05%Tween-20）120 μl，离心洗提出龈沟液。每份龈沟液中加入重组人IL-8(rhIL-8) （北京医科大学分子免疫室提供）［5］，在其终浓度达0.01mg/L后，把每份GCF样本一分为二，一份加入3mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，另一份加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)作对照，共计23对样本。37℃下、 30 min后，夹心ELISA法检测其中IL-8的含量(IL-8 检测试剂盒由第四军医大学免疫学教研室金伯泉教授惠赠)［6］ 。
　　5.间接ELISA法检测IL-8自身抗体(IgG)：用2mg/L rhIL-8包被96孔酶标板，3% BSA封闭后，每孔加40 μl龈沟液混合样本和10 μl大肠杆菌超声粉碎梯度液，每份样本做复孔。同时设阴性对照(不加龈沟液或HRP-羊抗人IgG)，HRP-羊抗人IgG工作浓度为1∶100。

结果

　　1.酶抑制实验结果：23份GCF样本（加PMSF）中检出的IL-8值为3.01mg/L±5.79 mg/L(±s)，高于加PBS的对照样本，后者的检出均值为0.05 mg/L±0.15 mg/L。经Sign检验 , 两组间差异有高度显著性，P<0.001。值得注意的是，两组IL-8的检出均值都低于试验前加入的0.01mg/L。
　　2.间接ELISA法检测结果：在各GCF混合样本中加入不同浓度的大肠杆菌粉碎液后，检出的IL-8自身抗体OD值的标准差均非常小(0.003)，IL-8自身抗体的平均检出OD值（0.042）高于阴性对照值标准差的3倍(0.034),证实GCF中有IL-8自身抗体。附图显示细菌超声粉碎液各浓度梯度与其相应IL-8抗体检出OD值的拟合曲线为一斜率近似零的直线（Y=0.000 4X + 4.227 2），说明大肠杆菌超声粉碎抗原对IL-8抗体的检出无明显影响。

责任编辑：姚红祥